近日，国际材料科学领域顶尖期刊Advanced Materials（中科院一区，影响因子32.086）在线发表了9778818威尼斯“生命分析技术与材料”科研团队的最新研究成果: “Engineered Phage with Aggregation-Induced Emission Photosensitizer in Cocktail Therapy against Sepsis”，有望为败血症的快速检测和治疗提供切实可行的临床方案。
败血症是由多种致病菌侵入血液循环，并在血液中生长繁殖产生毒素而引起的急性全身性感染疾病；严重时会导致多器官衰竭而危及生命，已被公认为世界范围内的一个重大健康问题。败血症病原菌种类的鉴定及快速诊断至关重要，临床上常用的是血培养和下一代测序(NGS)。然而，这些方法存在操作步骤繁琐复杂、耗时长和结果假阳性等缺点。此外，抗生素滥用导致的耐药性问题也增加了败血症治疗的难度。因此，迫切需要开发精确、安全、高效的新方法来检测和消除血液中的病原菌。
“噬菌体鸡尾酒疗法”现作为一种新的生物防控方法，在病原菌选择性消除方面显示了巨大的潜力，然而，低抗菌活性制约了噬菌体在临床治疗中的应用，尤其是急性感染。更重要的是虽然噬菌体能专一性靶向宿主细菌，但是因为缺乏灵敏的 “信号雷达”而难以实现病原菌的快速诊断及治疗过程的实时监测。
荧光成像技术已成为追踪生命过程和诊断疾病不可或缺的技术。具有聚集诱导发光性质（AIE）的荧光探针由于其低背景荧光、高信噪比和良好的光稳定性已成为细菌检测和成像中的可视化“雷达”。光敏剂（PS）作为一种特殊的荧光探针，既可以用于荧光成像也可以用于光动力治疗（PDT）。因此AIE-PS不仅可以为噬菌体提供一种可视化的“雷达”，用以精准高效识别和鉴定败血症中的病原菌，而且还可以联合噬菌体疗法和PDT协同抗菌，提高噬菌体的杀菌效率，实现败血症的高效治疗。
9778818威尼斯吴明雨博士和封顺教授课题组与武汉大学辜美佳博士以及陈实教授课题组合作，将具有高荧光量子产率和高活性氧产生性能的近红外AIE-PS（TBTCP-PMB）通过亲核取代反应共价修饰到噬菌体上，得到“TBTCP-PMB工程化噬菌体”，用于败血症病原菌的快速检测和血液消毒。该工作以题为“Engineered Phage with Aggregation-Induced Emission Photosensitizer in Cocktail Therapy against Sepsis”发表在《Advanced Materials》上。
【TBTCP-PMB的设计合成与光物理性质】
构建典型的D–π–A结构，选择双噻吩丙烯腈作为骨架，引入三苯胺（TPA）作为强给电子基团，吡啶鎓作为强吸电子基团，从而降低单重激发态和三重激发状态之间的能隙，提高系间窜越以提高ROS生成效率。此外，吡啶鎓基团上修饰苄基溴可以与噬菌体的巯基发生亲核取代反应实现噬菌体的共价修饰。实验结果表明，TBTCP-PMB具有典型的AIE特性，显示出近红外（NIR）发射、高荧光量子产率和优异的ROS和1O2生成效率。
图1. TBTCP-PMB的分子结构和光物理性质。
【TBTCP-PMB工程化噬菌体靶向细菌荧光成像与体外抗菌性能】
基于TBTCP-PMB出色的光学性能和噬菌体的宿主特异性识别功能，采用激光共聚焦显微镜考察TBTCP-PMB工程化噬菌体特异性识别宿主细菌的能力。研究表明TBTCP-PMB工程化噬菌体能选择性标记相应的宿主细菌膜并显示红色荧光，在短时间(约20分钟)内准确有效地识别相应的宿主细菌，实现相应细菌的鉴别，并且远远优于传统血液培养方法。
图2. TBTCP-PMB工程化噬菌体对宿主细菌的靶向荧光成像。
鉴于TBTCP-PMB工程化噬菌体兼备噬菌体能特异性识别宿主细菌和光敏剂TBTCP‑PMB的高ROS和1O2产率的多重优势，分别通过平板计数法、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜等手段评价其抗菌性能。平板计数法与激光共聚焦显微镜显示TBTCP-PMB工程化噬菌体表现出优异的抗菌性能，且远远优于单一的噬菌体或光敏剂的抗菌效果。进一步通过扫描电镜与透射电镜观察，加入TBTCP-PMB工程化噬菌体并经白光照射，所有宿主细菌细胞壁塌陷合并表面粗糙不规则，细胞膜严重受损。结果证实构建的TBTCP-PMB工程化噬菌体能选择性作用于宿主细菌且在光照后将其高效灭活。
图3. TBTCP-PMB工程化噬菌体的体外抗菌。
【TBTCP-PMB工程化噬菌体的体内抗菌性能】
基于TBTCP-PMB工程化噬菌体的体外高效抗菌性能，通过构建小鼠败血症模型进一步考察TBTCP-PMB工程化噬菌体的体内抗菌性能。研究表明，与对照组相比，未治疗组小鼠出现大量瘀斑、红斑等典型败血症症状，并于第4天全部死亡；用TBTCP-PMB工程化噬菌体处理的治疗组小鼠瘀斑、红斑症状随着时间延长而明显减少，第8天大部分小鼠仍存活，并对其器官进行H&E染色分析，治疗组的脏器病变均有所改善，组织学特征完整。由此证明TBTCP-PMB工程化噬菌体可以显著杀死宿主细菌并提高败血症小鼠的存活率。接着采用多因子检测败血症小鼠的免疫应答反应，结果显示用TBTCP-PMB工程化噬菌体处理并经白光照射的治疗组小鼠中炎症因子的表达均受到明显抑制。以上结果表明该工程化噬菌体对宿主细菌的靶向和杀伤作用及光敏剂在光照下能高效产生ROS用于细菌的高效灭活的多重功能相结合，赋予其良好的生物相容性的同时实现对宿主细菌的快速识别并高效灭活，进一步抑制炎症因子，改善组织纤维化，有利于细胞增殖、血管生成和组织修复，从而促进小鼠败血症的治愈和改善，表明TBTCP-PMB工程化噬菌体在败血症治疗中具有巨大的应用潜力。
图4. TBTCP-PMB工程化噬菌体的体内抗菌。
图5. 败血症小鼠不同器官的免疫荧光染色图像。
【TBTCP-PMB工程化噬菌体的临床应用】
收集湖北省妇幼保健医院不同败血症患者和健康的人的血液样本，进一步考察TBTCP-PMB工程化噬菌体的临床应用潜力。将血液样本前处理并采用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，结果显示，对于含有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的败血症血液样本，TBTCP-PMB工程化噬菌体成功地对细菌膜进行红色荧光标记且整个检测过程可以在30分钟内完成，这远远优于目前临床诊断败血症的方法(血液培养和下一代测序)。接着采用平板计数法，考察TBTCP-PMB工程化噬菌体在临床败血症血液样本中的杀菌效果。结果表明，经TBTCP- PMB工程化噬菌体处理并白光照射后，几乎没有任何菌落出现。以上实验结果证明TBTCP- PMB工程化噬菌体可用于临床败血症早期诊断与治疗。对于复杂的血液环境，TBTCP- PMB工程化噬菌体表现出良好的灵敏度、较短的检测时间和低的假阳性结果的特点。
图6. TBTCP-PMB工程化噬菌体对临床血液样本的检测。
【小结】
综上所述，该工作提出了一种新的AIE工程化噬菌体设计策略，将聚集诱导发射光敏剂 TBTCP-PMB与噬菌体结合得到“TBTCP-PMB工程化噬菌体”，用于败血症早期快速诊断和治疗。这种策略使工程化噬菌体兼具噬菌体的宿主特异性功能和光敏剂的高荧光量子产率，高ROS产率等多重优势，使其能特异性识别宿主细菌和杀灭细菌。这种结合噬菌体鸡尾酒疗法和光动力疗法（PDT）的协同策略在败血症小鼠模型中显示出强大的“1+1>2”抗菌效果且具有良好的生物相容性。此外，该策略可以快速诊断临床败血症血液样本的血液感染并远远优于传统临床败血症诊断方法。这种简单而准确的策略不仅为快速病原体检测和即时诊断提供了一个有前途的平台而且开发了一种新菌株鉴定和改善传染病治疗的新方法。
附论文链接地址: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202208578
9778818威尼斯吴明雨博士和封顺教授“生命分析技术与材料”科研团队近年来始终专注于生命健康领域的前沿基础理论研究和面向国家重大需求的应用研究，关注环境及食品安全和重大疾病的诊断与治疗。致力于开发光（荧光）、电（电化学）、色（色谱）响应/分离/富集的新材料和新方法，并将其应用于环境的检测、生命分析、药物/基因递送。承担国家自然科学基金重大项目、面上项目、青年项目和省部级基金等项目20余项，研究成果已发表在PNAS, Angew, Adv. Mater., Adv. Sci., Small, Biomaterials, Sci. China. Chem., Anal. Chem.,等国际顶级期刊。
